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關(guān)于細胞培養(yǎng)你了解了多少

更新時間:2020-04-20      點擊次數(shù):2711
   所有體外培養(yǎng)細胞,包括初代培養(yǎng)及各種細胞系,當生長達到一定密度后,都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細胞數(shù)量和細胞增殖速度等有關(guān)。接種細胞數(shù)量大、細胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下,細胞數(shù)量增加與飽和速度相對要快(實際上細胞接種數(shù)量大時細胞增殖速度比稀少時要快)。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞系比初代培養(yǎng)細胞增殖快,培養(yǎng)液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。
  所謂細胞“一代”一詞,系僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間,這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法,它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞,即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代(Generation)或倍增〔Doubling)不同;在細胞一代中,細胞能倍增3~6次。細胞傳一代后,一般要經(jīng)過以下三個階段:
  1.潛伏期(Latent Phase):
  細胞接種培養(yǎng)后,先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上,稱貼壁,懸浮期結(jié)束。各種細胞貼附速度不同,這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細胞貼附慢,可長達10~24小時或更多;連續(xù)細胞系和惡性細胞系快,10~30分鐘即可貼附。細胞貼附現(xiàn)象是一個非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細胞的貼附;底物表面不潔不利貼附,底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中,有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素(Fibronectin),又稱LETS(Larger External Transformation Substance),細胞表面蛋白(Cell Surface Protein:CSP)等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分,它們有的存在于細胞膜的表面(如 CSP),有的則來自培養(yǎng)基中的血清(LETS)。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。
  細胞貼附于支持物后,除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細胞,還要經(jīng)過一個潛伏階段,才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時,可有運動活動,基本無增殖,少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細胞潛伏期長,約24~96小時或更長,連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短,僅6~24小時;細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時,標志細胞已進入指數(shù)增生期。
  2.指數(shù)增生期(Logarithmic growth Phase):
  這是細胞增值旺盛的階段,細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂(Mitotic Index:MI)表示,即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%~0.5%,初代細胞分裂指數(shù)低,連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%~5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細胞一代中活力好的時期,因此是進行各種實驗好的和主要的階段。在接種細胞數(shù)量適宜情況下,指數(shù)增生期持續(xù)3~5天后,隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后,如培養(yǎng)的是正常細胞,由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動,這種現(xiàn)象稱接觸抑制(Contact Inhibition)。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象,因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖,導(dǎo)致細胞向三維空間擴展,使細胞發(fā)生堆積(Piled up)。細胞接觸匯合成片后,雖發(fā)生接觸抑制,只要營養(yǎng)充分,細胞仍然能夠進行增殖分裂,因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大,培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少,代謝產(chǎn)物增多時,細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響,則發(fā)生密度抑制(Density Inhibition),導(dǎo)致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念,不應(yīng)混淆。
  3.停滯期(Stagnate Phase):
  細胞數(shù)量達飽和密度后,細胞遂停止增殖,進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加,故也稱平頂期(Plateau)。停滯期細胞雖不增殖,但仍有代謝活動,繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡,代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代,否則細胞會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,重則從底物脫落死亡,故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚(已有中毒跡象)能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下,雖進行了傳代,因細胞已受損,需要恢復(fù),至少還要再傳1~2兩代,通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復(fù)后,才能再用。結(jié)果反而耽誤了時間,這是在實驗中應(yīng)特別注意的。
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