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ATCC細胞株的凍存與復(fù)蘇

更新時間:2016-08-25      點擊次數(shù):2849
     ATCC細胞株是用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法,由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質(zhì)或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代成功后即為細胞系(cell line), 由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系所組成。
    ATCC細胞株是通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標志的培養(yǎng)細胞。從培養(yǎng)代數(shù)來講,可培養(yǎng)到40-50代。細胞株的特殊性質(zhì)或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。對于人類腫瘤細胞,在體外培養(yǎng)半年以上,生長穩(wěn)定,并連續(xù)傳代的即可稱為連續(xù)性株或系。
    ATCC細胞株的凍存與復(fù)蘇:
    一、細胞的凍存:為避免污染造成的損失,zui小化連續(xù)細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉(zhuǎn)化,需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前,細胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。
    有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基,成分可能如下:
    ◆包含10%甘油的*培養(yǎng)基,
    ◆包含10%二甲基亞砜(DMSO)的*培養(yǎng)基,
    ◆50%細胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%甘油的新鮮培養(yǎng)基,或
    ◆50%細胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
    對于無血清培養(yǎng)基,一些普通的培養(yǎng)基成分可能是:
    ◆50%細胞條件無血清培養(yǎng)基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基,或
    ◆包含有7.5%二甲基亞砜和10%細胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。
    1.懸浮細胞
    ●計數(shù)將要凍存的活細胞。細胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。以大約200~400g離心5分鐘沉淀細胞,使用移液管移去上清到zui小體積,不要攪亂細胞。
    ●以1×107到5×107細胞/ml密度,在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細胞,或者以0.5×107到1×107在無血清培養(yǎng)基中,再次懸浮細胞。
    ●分裝進凍存管,將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
    ●細胞以1℃/分鐘進行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
    2.貼壁細胞
    ●使用分離試劑從基層分離細胞,分離時盡可能溫和,使對細胞的損傷減少到zui小。
    ●在*生長培養(yǎng)基中,再次懸浮分離細胞,確定有活力細胞數(shù)。
    ●以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到zui小體積,不要攪亂細胞。
    ●以5×106到1×106細胞/ml密度,在凍存液中懸浮細胞。
    ●分裝進凍存管,將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
    ●細胞以1℃/分鐘進行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
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